Полисомное профилирование - Polysome profiling

Полисомы

Полисомное профилирование это техника в молекулярная биология который используется для изучения ассоциации мРНК с рибосомы. Важно отметить, что этот метод отличается от профилирование рибосом. Оба метода были рассмотрены[1] и оба используются при анализе переводчик, но данные, которые они генерируют, имеют очень разные уровни специфичности. При использовании экспертами метод замечательно воспроизводится: 3 профиля на первом изображении взяты из 3 разных экспериментов.[2]

Процедура

Процедура начинается с создания клеточный лизат интересующих ячеек. Этот лизат содержит полисомы, моносомы (состоящие из одной рибосомы, расположенной на мРНК ), малый (40S в эукариоты ) и большие (60S у эукариот) рибосомные субъединицы, «свободная» мРНК и множество других растворимый клеточные компоненты.

Процедура продолжается путем непрерывного сахароза градиент бесступенчатой ​​плотности в центрифуга трубка. В используемых концентрациях (15-45% в примере) сахароза не нарушает ассоциации рибосом и мРНК. Часть градиента 15% находится в верхней части трубы, а часть 45% находится внизу из-за их различных плотность.

Определенная сумма (измеряется оптическая плотность ) лизата затем аккуратно наслаивают поверх градиента в пробирке. Лизат, даже несмотря на то, что он содержит большое количество растворимого материала, намного менее плотен, чем 15% сахароза, и поэтому его можно сохранить в виде отдельного слоя в верхней части пробирки, если это делать осторожно.

Для разделения компонентов лизата препарат подвергают центрифугированию. Этот ускоряет компоненты лизата во много раз больше сила притяжения и таким образом продвигает их через градиент в зависимости от того, насколько «большие» отдельные компоненты. Маленькие (40S) субъединицы проходят менее далеко в градиент, чем большие (60S) субъединицы. Рибсомы 80S на мРНК перемещаются дальше (обратите внимание, что вклад размера мРНК в пройденное расстояние не является значительным). Полисомы, состоящие из 2 рибосом, перемещаются дальше, полисомы с 3 рибосомами перемещаются еще дальше и так далее. «Размер» компонентов обозначен буквой S, Сведберг единица. Обратите внимание, что один S = 10−13 секунд, и что понятие «большой» на самом деле является чрезмерным упрощением.

градиент сахарозы и иммуноблот

После центрифугирования содержимое пробирки собирают в виде фракций сверху вниз (меньшие, перемещающиеся медленнее) и вниз (более крупные, перемещающиеся быстрее), и определяют оптическую плотность фракций. Первые удаленные фракции содержат большое количество относительно небольших молекул, таких как тРНК, отдельные белки и т. Д.

Приложения

Этот метод можно использовать для исследования общей степени трансляции в ячейках (например,[3][4][5]), но его можно использовать гораздо более конкретно для изучения отдельных белков и их мРНК. В качестве примера, показанного в нижней части рисунка, белок, который составляет часть малой субъединицы, может сначала быть обнаружен во фракции 40S, затем почти исчезает из фракции 60S (разделение на этих градиентах не является абсолютным), а затем снова появляется. во фракциях 80S и полисомов. Это указывает на то, что в клетке содержится очень мало белка, который не является частью маленькой субъединицы. Напротив, в верхнем ряду рисунка иммуноблота растворимый белок появляется в растворимых фракциях и связан с рибосомами и полисомами. Конкретный белок представляет собой шаперонный белок, который (вкратце) помогает складывать зарождающиеся пептид поскольку он выдавливается из рибосомы. Как и другие работы

PolysomesmRNA.jpg

в показанной статье существует прямая ассоциация шаперона с рибосомой.[2]

Этот метод также можно использовать для изучения степени трансляции определенной мРНК.[6] В этих экспериментах 5 'и 3' последовательности мРНК были исследованы на предмет их влияния на количество продуцируемой мРНК и насколько хорошо транслируются мРНК. Как показано, не все изоформы мРНК транслируются с одинаковой эффективностью. хотя их кодирующие последовательности одинаковы.[6]

Рекомендации

  1. ^ Пиччирилло, Калифорния; и другие. (2014). «Трансляционный контроль иммунных ответов: от транскриптов к трансатомам». Иммунология природы. 15 (6): 503–511. Дои:10.1038 / ni.2891. PMID  24840981.
  2. ^ а б Hanebuth, Массачусетс; и другие. (2016). «Поливалентные контакты Hsp70 Ssb способствуют его архитектуре на рибосомах и взаимодействию зарождающейся цепи». Nature Communications. 7: 13695. Bibcode:2016НатКо ... 713695H. Дои:10.1038 / ncomms13695. ЧВК  5150220. PMID  27917864.
  3. ^ Lin, CJ; и другие. (2010). «Антидепрессант сертралин подавляет инициацию трансляции, ограничивая млекопитающих-мишеней передачи сигналов рапамицина». Исследования рака. 70 (8): 3199–3208. Дои:10.1158 / 0008-5472.CAN-09-4072. PMID  20354178.
  4. ^ Coudert, L; и другие. (2014). «Анализ инициации трансляции в стрессовых условиях по полисомному профилированию». Журнал визуализированных экспериментов (87). Дои:10.3791/51164. ЧВК  4193336. PMID  24893838.
  5. ^ Молон, М; и другие. (2016). «Скорость метаболизма как фактор, определяющий долголетие дрожжей Saccharomyces cerevisiae». Возраст (Дордрехт, Нидерланды). 38 (1): 11. Дои:10.1007 / s11357-015-9868-8. ЧВК  5005888. PMID  26783001.
  6. ^ а б Этаж, СН; Дудна, Дж. А. (2016). «Настраиваемый синтез белка изоформами транскриптов в клетках человека». eLife. 5. Дои:10.7554 / eLife.10921. ЧВК  4764583. PMID  26735365.